服務(wù)熱線
021-54479081
021-54461587
-
DEAE-Sephadex A-50提取法純化多克隆抗體
發(fā)布時(shí)間： 2010-10-28 點(diǎn)擊次數(shù)： 2543次DEAE-Sephadex A-50（簡(jiǎn)稱A-50）為弱堿性陰離子交換劑，經(jīng)過(guò)NaOH處理將Cl-型轉(zhuǎn)為OH-型后，可吸附酸性蛋白。γ1球蛋白屬中性蛋白，等電點(diǎn)為pH6.85～7.5，其余均屬酸性蛋白。在溶液為pH8.0時(shí)，酸性蛋白均被A-50 吸附。從而可分離純化IgG。
1. 批量吸附法
此法可在1天內(nèi)完成提取過(guò)程，純化前后樣品體積變化不大，所得IgG無(wú)變性現(xiàn)象，抗體效價(jià)亦無(wú)明顯降低。制品可達(dá)PAGE及免疫電泳純。適用于提純?nèi)?、羊、兔等血清中的IgG。【材料和試劑】
（1）DEAE-Sephadex A-50。
（2）PB緩沖液：0.01mol/L，pH6.5 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液。【操作步驟】
（1）A-50的預(yù)處理：稱取4～6g A-50懸浮于500～1000ml蒸餾水中，1h后傾去上層細(xì)粒。然后將A-50浸泡于0.5mol/L NaOH液（60～100ml）中，攪拌后靜置30min，以蒸餾水洗至中性，再用0.1mol/L NaH2PO4同上操作過(guò)程處理，蒸餾水洗至中性。zui后用0.01mol/L，pH6.5 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（PB）平衡，減壓抽干，保存?zhèn)溆谩?/p>（2）吸附提取：取15ml血清加等量0.01mol/L，pH6.5 PB稀釋至30ml（也可不稀釋），加入1/4體積濾干的DEAE-Sephadex A-50（相當(dāng)于干重1g）混合。室溫（或4℃）浸泡1 h后過(guò)濾，收集濾液。再加入同樣體積的DEAE-Sephadex A-50重復(fù)上述處理過(guò)程共3次，亦可在血清內(nèi)加入過(guò)量DEAE-Sephadex A-50吸附處理一次。收集濾液合并，即為提純的IgG制品?；蛟偻肝鋈}，濃縮、凍干保存?zhèn)溆谩?/p>
2．A-50柱層析法
【材料和試劑】
（1）DEAE-Sephadex A-50。
（2）待純化標(biāo)本：雜交瘤腹水或培養(yǎng)上清，免疫血清或飽和硫酸銨粗提品。
（3）1.5×50cm 層析柱；透析袋及其他透析和層析所需的試劑和器材。
（4）PB緩沖液：0.1mol/L，pH7.4 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液。【操作步驟】
（1）A-50經(jīng)酸堿處理，平衡至中性后，浸泡于0.1mol/L，pH7.4 PB中，置4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br />（2）裝柱：同DE52。
（3）平衡：松開出水口螺旋夾，以PB平衡，控制流速為15滴/min，待洗脫液與流出液之pH值達(dá)到一致時(shí)，停止平衡。
（4）加樣、洗脫、收集與濃縮：基本上同DE52，以0.1mol/L PB洗脫。
用過(guò)的DEAE-Sephadex A-50可用0.5mol/L Na2HPO4洗脫回收。洗至流出液中無(wú)蛋白（OD280nm<0.04）后再用蒸餾水洗至中性，加入0.02％疊氮鈉于4℃保存?zhèn)溆谩?br />